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効果測定・試験結果

FMI次亜塩素酸水(商品名ジアユーズ)のコロナウイルス溶液 に対する失活効果測定

*国立病院機構仙台医療センターウイルスセンターにてセンター長医師西村秀一先生の指導の下、実施

1.概要

•目的 : 次亜塩素酸水 商品名ジアユーズ によるコロナウイルス培養液サンプルに対する不活化効果の検証

• 方法: 次亜塩素酸水とコロナウイルス液を等量混合したテストサンプルと、
次亜塩素酸水と精製水 /MEM 培養液を等量混合したコントロールサンプルに、
細胞変性効果試験 TCID 50 を実施し、その結果を比較検討することによって、
次亜塩素酸水のコロナウイルス不活化効果を判定しようとした。

• 結果: 200ppm の次亜塩素酸水溶液 商品名ジアユーズ は、
1wt% のトリプシンを含むコロナウイルス 229E 水溶液に対して優れた不活化効果を発揮し、
1 分間の感作時間で 99.96% 以上の不活化率を示した。

2.方法

1)測定条件

1.1 試験ウイルス: コロナウイルス(229E)
1.2 試験消毒液 : 200ppm 次亜塩素酸水
1.3 試験場所:仙台医療センターウイルスセンター
1.4 日程 :2020年3月12日、3月12日~3月18日培養操作(incubation)、3月18日測定終了・結果報告書
1.5 担当: ウイルス培養・感染価測定Isolde Dapat, PhD(ウイルスセンター)
温湿度消毒環境の設定と消毒操作阪田(メディエアジャパン)

2)細胞変性効果試験(TCID50*)手順

3)細胞毒性試験手順

本報告書におけるコロナウイルス229E の
不活化効果の検証試験では、ウイルスの増殖にアカゲザル由来の腎臓細胞 LLC MK2 を使用した。
図1の HClO の消毒剤 A をウイルス液 B と混合して、培養細胞 LLC MK2 に接種する際、
事前に培養細胞が消毒液 A の毒性によって細胞がダメージを受けない消毒液の濃度範囲をウイルスを使用しない細胞毒性試験で明らかにする必要がある。
培養細胞がダメージを受ける濃度条件下では、ウイルスが健全な細胞に感染して、細胞変性を起こすか否かでウイルス感染価を判定する TCID 50 の手法そのものが適用できない。

3.結果

1)細胞変性効果試験(TCID50*)結果

2)細胞毒性試験結果

図2のの細胞毒性試験結果は、2倍希釈すれば細胞毒性が弱まり、 Control に近づく。
図 1 を見てわかるように、200ppm 次亜塩素酸水Aは、ウイルス液Bと等量混合される際に既に 2倍希釈されている。
従って、(A+B)の混合液は、薄めることなく、そのままの濃度で細胞変性効果試験( TCID50 **)を実施し、表2の不活化率を求めることができた。

3)試験結果のまとめ

200ppmの次亜塩素酸水溶液“ジアユーズ”は、1wt%のトリプシンを含むコロナウイルス229E水溶液に対して優れた不活化効果を発揮し、1分間の感作時間で 99.96% 以上の不活化率を示した。
現在の COVID-19コロナウイルスに汚染された表面に対しても、スプレー噴霧による濡れ面を形成することによって、速やかな不活化除染作用を発揮することが可能である。

空気清浄技術の浮遊インフルエンザウイルス不活化効果評価

インフルエンザウイルスについて

インフルエンザウイルスにはA、B、Cの3つの型がある。
現在、インフルエンザウイルスで流行を起こすのはH1亜型(ソ連カゼ)、
H3亜型(香港カゼ)などのA型と、B型である。
ウイルスの構造を右の模式的に示す。
インフルエンザウイルスの型は核タンパク質(NP)の抗原性の違いによって分類され、
それらはさらに、ウイルス表面タンパク質であるヘマグルチニン
(haemagglutinin:以下HAと略す)と
ノイラミダーゼ(neuraminidase:以下NAと略す)の抗原性の違いによって亜型に分類される。
ちなみに死者のでるA型については、ソ連カゼはH1N1型、香港カゼはH3N2型である。

1.浮遊インフルエンザウイルス感染性と温湿度の関係

1)Harperによる温湿度依存性解明

著者: Harper, G.J.
論文名:Air-bone micro-organisms: survival test with
four viruses.
雑誌名:J Hyg Camb. Vol.59, (1961) p.479~86

図1~3にまとめた。湿度が高いほど、また温度が高いほど、浮遊インフルエンザウイルスは不活化するという結果となっている。
相対湿度が50%前後を超えると、浮遊インフルエンザウイルスの不活化は著しい。

2.浮遊インフルエンザウイルス感染性と温湿度の関係

2)仙台医療センターウイルウセンターにおける温湿度依存性解明

著者: 西村秀一他
論文名: (B-7) くしゃみによるエアロゾル粒子と空中エアロゾル中のインフルエンザウイルスの活性の解析
Analyses on the aerosol particles by sneezing and the viability of influenza virus
in the air-borne particles.
雑誌名:第25回空気清浄とコンタミネーションコントロール研究大会予稿(2007) p.81~83.

図4~5にまとめた。湿度が高いほど、また温度が高いほど、浮遊インフルエンザウイルスは不活化するという結果となり、Harperの結果と一致した。
また、詳細はここでは省くが、インフルエンザの種類A,B,Cを問わず、温湿度依存性は変わらなかった。

3.浮遊インフルエンザウイルス不活化効果の評価

1)空気清浄機の浮遊ウイルスに対する除去性能評価試験方法

2011 年(平成23 年)7 月4 日制定
一般社団法人日本電機工業会
以下、抜粋
4.試験微生物
WHO ガイドライン及び「国立感染症研究所病原体等安全管理規程」においてBSL2(バイオセフティーレベル2;Biosafety Level 2)以上に区分されている微生物(インフルエンザウイルス等)の使用にあたっては、病原体等の管理と使用に関する現行の法律および指針の順守が必要である。

1) 大腸菌ファージと宿主菌
2) インフルエンザウイルスA 型と宿主細胞:(下記は代表例)
① Influenza A virus H1N1(A/PR/8/34) ATCC VR-95 等
② Influenza A virus H3N2 (A/Aichi/2/68) ATCC VR-547 等
阪田コメント:1)の大腸菌ファージは、大腸菌に感染して殺すウイルスのこと。
大腸菌ファージが殺すのは大腸菌だけで、ヒトには全く無害なウイルスである。
インフルエンザウイルスとは全く異なる種類のウイルスで、浮遊インフルエンザウイルスの不活化効果を評価するために、インフルエンザウイルスと代替することは無理がある。
現在国内で、2)のインフルエンザウイルスA 型を使用して空気清浄機を評価できるのは、仙台医療センターウイルスセンターのみである。

2)極微量消毒ガスを用いた浮遊ウイルス不活化効果の評価

浮遊インフルエンザウイルスを不活化可能なヒトの健康に害を及ぼさない極微量消毒ガス(数ppb~50ppb)としては、二酸化塩素、オゾン、過酸化水素、次亜塩素酸、等がある。
二酸化塩素については、不活化効果の詳細が図6のように公表されている。

環境感染誌Vol. 32 no. 5, 2017, p.243-249
低濃度二酸化塩素による空中浮遊インフルエンザウイルスの制御
―ウイルス失活効果の湿度依存性―
西村秀一他

二酸化塩素ガス以外のガス種についても、次亜塩素酸を除き、同等の失活特性が得られている。

3)FMI(次亜塩素酸)を用いた浮遊ウイルス不活化効果の評価

FMIによる極微量次亜塩素酸ガス発生は、従来、他のガス種では不可能であった室温30-35%RHの乾燥雰囲気中における浮遊インフルエンザウイルスの失活が可能であることが明らかになった。
図6に示したように、他のガス種が50%RHを超える高湿度雰囲気中でのみ、浮遊ウイルス失活効果を有する。
一方、次亜塩素酸ガスは、図7に示したように、30-35%RHの乾燥雰囲気中においても浮遊ウイルス失活効果を有する。
室温下で、50%RH以上に湿度を高めることは、カビ類の発生を容易にし、肺炎やアレルギーの原因となりうる。FMIが30-50%RHの乾燥雰囲気中で失活効果を有することは、画期的な特性といえる。

「インフルエンザウィルスの失活装置及び失活方法」特許取得証

FMI次亜塩素酸ガスの付着インフルエンザウイルスに対する失活効果測定*

Part 1:FMI次亜塩素酸ガス発生によるA型インフルエンザスメアサンプルに対する不活化効果の検証

*国立病院機構仙台医療センターウイルスセンターにて, センター⾧医師西村秀一先生の指導の下、実施

概要

• 目的:表面付着インフルエンザウイルスに対するFMI装置発生の次亜塩素酸ガス の消毒効果の検証 • 方法:インフルエンザウイルス液を滴下した“ドロップサンプルD”をさらに擦り付けて “スメアサン プルS”を作成する。サンプルSは、気流中で完全に乾燥させる。 FMI装 置から、密閉グローブボックス内において、次亜塩素酸ガスを一定時間発 生する。乾燥後のサンプルSは、次亜塩素酸ガス存在下のグローブ ボックス内雰囲気中に一定時間暴露した後取り出す。暴露前後の感染 価の変化を測定して、次亜塩素酸ガスの消毒効果を検証する。 • 結果:平均濃度5ppb(推定)の次亜塩素酸ガス雰囲気中に暴露されたインフルエン ザスメアサンプルSの感染価は、30分後には26%、60分後には8%に低下した。 次亜塩素酸ガスの付着インフルエンザウイルスに対する失活効果が確認された。

方法

1. パラメータ

1.1 試験ウイルス: インフルエンザウイルスA型 Influenza A virus H3N2(A/Aichi/2/68) 1.2 試験消毒ガス: FMI装置発生の次亜塩素酸ガス 1.3 試験場所:仙台医療センターウイルスセンター 1.4 日程: 2020年8月6日 1.5 担当: ウイルス培養・感染価測定 イゾルデ・ダパト(仙台医療センターウイルスセンター) 温湿度消毒環境の設定と消毒操作 阪田総一郎(㈱メディエアジャパン)

2. 試験手順

プラシャーレ底面にインフルエンザウイルス液が滴下された汚染表面“D”をさらに擦り付けて放置した汚染 表面”Sを、FMI次亜塩素酸ガス発生装置により、次亜塩素酸ガスを発生させた密閉グロブボッ クス内にいれる。ガス暴露時間を変えて、感染価の時間変化を測定する。

2-1. ドロップとスメア

ドロップを擦り拡げてスメアサンプルを作成する操作は安全キャビネット内で実施する。 スメアサンプル10ケの内、作成直後の2ヶ(Ref.)は1mLメディウムを注ぎ込み、表面付着物をこ そぎ落として感染価を測定する。他のControl用4ヶとTest用4ヶは、相対湿度100%の密閉 ボックスに入れ、安全キャビネットから試験場所まで移動する2-3分間の間、乾燥を防ぐ。

2-2. プラシャーレ底面への滴下ウイルス液の擦りつけ操作

2-3. スメアサンプルの乾燥法

乾燥防止用保管箱に入れて、安全キャビネットから試験場所まで移動したスメアサン プル8ヶは、下図に示すように、20℃20%RHの環境試験室内において、速度5-6m/sの 気流中において、20分間乾燥する。

2-4. 次亜塩素酸ガスによる表面付着インフルエンザウイルスの消毒効果測定

FMI装置は、発生する次亜塩素酸ガスを利用して室温20℃相対湿度30-35%RHにおける居住環境の浮遊インフルエンザウイルス不活化に既に利用されている(特許第6654276号)。そこ で、同じ温湿度条件下で、付着インフルエンザウイルスに対する不活化効果を評価する。

41m3環境試験室内に設置した1.2m3のグローブボックス内に、FMI次亜塩素酸発生装置と 理研計器TP-70D塩素ガス濃度計(次亜塩素酸ガスと兼用)とT&D製温湿度計を設置す る。 41m3環境試験室内は、常時20℃10-15%RHの乾燥雰囲気に維持されている。FMI 装置に単に精製水を入れて、グローブボックス内を最初環境試験室と同等の乾燥雰囲気に維 持して35%RHまで運転した場合(Control)と、精製水にFMIの次亜塩素酸ガス発生用 ジアユーズ薬剤を既定の2倍だけ入れた薬液を用いてControlと同様の運転をした場合 (Test)について、表面付着インフルエンザウイルスの消毒効果を測定した。 FMI次亜塩素酸発生装置は、薬液攪拌式により次亜塩素酸ガスを発生する。他の超 音波式とは異なり、加湿量は少ないが、浮遊インフルエンザウイルス不活化効果が検証されている。

まとめと考察

1)インフルエンザA溶液1μLを10滴滴下した表面を、擦り拡げたスメアサンプル を使用して、次亜塩素酸ガスの消毒効果を測定した。 2)作成直後のスメアサンプルを、直ちに20℃15-20%RHの5-6m/sの気流中で20分 間乾燥した。この乾燥操作によっても、乾燥後の感染価は乾燥前の53%を回 収できた。 3)さらに1時間、20℃15-20%RHのほぼ静止した乾燥空気中に放置しても、 感染価は全く変わらなかった。 4)平均濃度5ppb(推定)の次亜塩素酸ガス雰囲気中に暴露されたインフルエン ザスメアサンプルの感染価は、30分後には26%、60分後には8%に低下した。 次亜塩素酸ガスの付着インフルエンザウイルスに対する失活効果が確認された。

次亜塩素酸水(商品名ジアユーズ)の溶液ノロウイルスに対する失活効果測定

*国立病院機構仙台医療センターウイルスセンターにてセンター長医師西村秀一先生の指導の下、実施

1.概要

• 目的: 次亜塩素酸水 商品名ジアユーズ をノロウイルス培養液サンプルに混合した場合、
及びノロウイルス培養液のガラス表面塗布乾燥した汚染表面に対してスプレー噴霧した場合、
それぞれの不活化効果の検証する。

• 方法: 次亜塩素酸水とノロウイルス液を等量混合したテストサンプルと、
精製水 /MEM 培養液とノロウイルス液を等量混合したコントロールサンプルに、
細胞変性効果試験 (TCID50)を実施した。
その結果から次亜塩素酸水のノロウイルス不活化効果を判定しようとした。
さらに、ノロウイルス培養液のガラス表面塗布乾燥した汚染表面に対して、
次亜塩素酸水をスプレー噴霧した場合のTCID50測定を実施し、ノロウイルス表面汚染の不活化効果を判定した。

• 結果:次亜塩素酸水とノロウイルス液を等量混合した液ー液試験については、
次亜塩素酸水濃度が 200ppm の場合、
混合放置時間が1分間、10分間いづれの場合も感染性ウイルス残留率は各々0.74%以下0.01%以下で、
100ppm の場合と比較して1桁以上少ない。
スプレー噴霧試験について、噴霧後10分経過時の感染性ウイルス残留率は、
200ppmの場合3.3% 以下、600ppm の場合 0.5%以下であった。

2.方法

2-1. 測定条件

1) 試験ウイルス : マウスノロウイルス (MNV)
2) 試験消毒液 : 100,200,600ppm 次亜塩素酸水
3) 試験場所:仙台医療センターウイルスセンター
4) 日程 :2020年3月12日、3月12日~3月18日培養操作 (incubation) 、3月18日測定終了・結果報告書
5) 担当:ウイルス培養・感染価測定 Isolde Dapat ,PhD(ウイルスセンター)
温湿度消毒環境の設定と消毒操作 阪田(メディエアジャパン)

2-2.液ー液テストによるウイルス不活化試験

2-3.液ー表面テスト 噴霧 によるウイルス不活化試験

ガラス面にノロウイルス液が滴下された汚染表面"D"をさらに擦り付けて放置した汚染表面"S"に対して、
次亜塩素酸水(商品名ジアユーズ)をスプレー噴霧・吹き付ける。
1) スメアサンプルに対する次亜塩素酸水のスプレー噴霧
①ガラス面滴下ウイルス液の擦り付け操作

②スメアサンプルの3通りの処理
スメア操作後のガラスサンプルは3通りに処理され、20℃20%RH条件下に5分間放置。
コントロール:20℃20%RH条件下で純水を噴霧滴下、10分間放置する。
テスト1:次亜塩素酸水(商品名ジアユーズ)600ppmを噴霧滴下、10分間放置する。
テスト2:次亜塩素酸水(商品名ジアユーズ)200ppmを噴霧滴下、10分間放置する。

2)ウイルス感染価の回収
ラビング法:回収したガラスプレート上の付着液膜は、
噴霧液約0.8-0.9mℓ に浸したシリコンラバーを使用して、繰り返し擦りながら洗い出す。

2-4.細胞毒性試験手順

本報告書におけるマウスノロウイルスMNVの不活化効果の検証試験では、
ウイルスの増殖にマウスマクロファージ株細胞 RAW264.7を使用した。
図1の HClO の消毒剤Aをウイルス液Bと混合して、培養細胞RAW264.7に接種する際、
事前に培養細胞が消毒液Aの毒性によって細胞がダメージを受けない消毒液の濃度範囲をウイルスを使用しない細胞毒性試験で明らかにする必要がある。

培養細胞がダメージを受ける濃度条件下では、ウイルスが健全な細胞に感染して、
細胞変性を起こすか否かでウイルス感染価を判定するTCID50の手法そのものが適用できない。

3.結果

3-1.細胞変性効果試験(TCID50)結果

3-2.細胞毒性試験結果

図5の細胞毒性試験結果は、
200ppmにおいては、4倍希釈すれば細胞毒性が弱まり、600ppmにおいては、
16倍希釈して細胞毒性が弱まり、それぞれControlに近づく。

3-3.試験結果のまとめ

•次亜塩素酸水とノロウイルス液を等量混合した液ー液試験については、
次亜塩素酸水濃度が 200ppm の場合、混合放置時間が1分間、10分間いづれの場合も感染性ウイルス残留率は
各々0.74% 以下 以下で、100ppmの場合と比較して1桁以上少ない。

•スプレー噴霧試験について、噴霧後 10 分経過時の感染性ウイルス残留率は、
200ppmの場合 3.3% 以下、600ppm の場合 0.5% 以下であった。

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